4. Kultivace
Během kultivace dochází také ke dvojité selekci pozitivních klonů. Kultivační médium jednak obsahuje antibiotikum, vůči kterému budou rezistentní pouze buňky s vektorem, neboť vektor nese gen pro rezistenci. Na misce tedy vyrostou pouze buňky obsahující vektor.
Cílem druhé selekce je odlišit klony buněk obsahující vektor bez inzertu od klonů nesoucích vektor s inzertem. Nejčastěji se používá tzv. modro-bílá selekce, kdy klonovací místo vektoru obsahuje gen LacZ kódující enzym β-galaktosidázu. Tento enzym přeměňuje bezbarvou galaktozu X-Gal (obsaženou v médiu) na 5-bromo-4-chloro-indoxyl, který spontánně oxiduje a tvoří modré barvivo. Pokud se tedy inzert vloží do klonovacího místa, je gen rozštěpen a daná buňka nebude metabolizovat X-Gal. Tato buňka bude tvořit bílé kolonie, zatímco buňky, u kterých nedošlo k integraci inzertu do vektoru, budou mít gen LacZ neporušený a bude se tvořit modré zbarvení. Pro kontrolu, zda klony nesou inzert, lze použít i PCR nebo restrikční štěpení.