Polymerázová řetězová reakce

V úvodu si nejprve vysvětlíme základní princip PCR a následně se přesuneme k popisu konkrétní kvantitavní PCR reverzní transkripce. PCR neboli polymerázová řetězová reakce je metoda, která využívá aktivity nejrůznějších termostabilních polymeráz k množení vybraných úseků DNA. Výběr úseků se obvykle děje pomocí oligonukleotidů, jejichž sekvence jsou komplementární k jednomu z řetězců DNA a ohraničují tak začátek amplifikace. Reakce probíhá v teplotních cyklech, které jsou nejčastěji tříkolové – denaturace, připojení primérů, syntéza. Vznik produktu může být sledován plynule, nebo až po skončení reakce.

Kvantitativní PCR reverzní transkripce neboli RT-qPCR

PCR Tato metoda se používá za předpokladu, je-li výchozím materiálem RNA. Při RT-qPCR je nejprve RNA přepsána do komplementární DNA reverzní transkriptázy (cDNA), nebo do messenger RNA (mRNA). CDNA se následně využije jako templát pro rekci qPCR. Kvantitativní PCR reverzní transkripci využijete v mnoha aplikacích, především pak v analýze genové exprese, při validaci RNAi, validaci microarray, detekci patogenů a v neposlední řadě i při genetickém testování a výzkumu onemocnění.

 

Veškeré pomůcky pro standardní, real-time, direct a hot start PCR si můžete rovnou objednat v našem eshopu, nebo prostřednictvím kontaktního formuláře pod tímto článkem.

Rozdíly mezi jednokrokovou a dvoukrokovou RT-qPCR

Výše vysvětlená RT-qPCR může být buď jednokroková, nebo dvoukroková. Jednokrokové kity kombinují reverzní transkripci a PCR v jedné jediné zkumavce a pufru. K tomuto procesu lze použít buď jeden enzym s reverzní transkriptázovou a polymerázovou aktivitou, nebo reverzní transkriptázu společně s DNA polymerázou. Jednokroková RT-qPCR využívá pouze sekvence specifických primerů. Oproti tomu dvoukroková RT-qPCR se provádí v oddělených zkumavkách s různými optimalizovanými pufry.

Výhody jednokrokové RT-qPCR Výhody dvoukrokové RT-qPCR
méně pipetovacích kroků sníží riziko kontaminace cílové a referenční geny mohou být zesíleny ze stejné c DNA pool bez multiplexu
rychlá a vysoce reprodukovatelná optimalizované reakční pufry a reakční podmínky mohou být použity pro jednotlivé reakce
vhodná pro vysoké propustnosti zesílení / screeningu velmi flexibilní možnosti použití

Důležité kroky při reverzní transkripci v RT-qPCR

1)  Výběr celkové RNA versus mRNA

Jakmile začnete navrhovat test RT-qPCR, je důležité se rozhodnout, zda použijete celkovou RNA, nebo mRNA vyčištěnou jako templát pro reverzní transkripci. mRNA může poskytnout o něco větší citlivost, avšak nejčastěji se doporučuje zvolit za výchozí materiál spíše RNA, a to hned z několika důvodů:

  • je zapotřebí méně čisticích kroků, což zajistí větší kvantitavní obnovení templátu a tím pádem také lepši schopnost normalizovat výsledky výchozího poču buněk
  • vyhnete se obohacování mRNA a tím snížíte riziko zhoršení výsledků v důsledku odlišné výnosnosti obnovy
  • celková RNA se doporučuje zejména proto, že realtivní kvantifikace cílů je důležitější než absolutní citlivost detection1

2) Výběr primerů pro reverzní transkripce

Pro základní cDNA reakci u dvoukrokových kitů lze použít tři různé přístupy: oligo (dT) primery, náhodné primery, nebo sekvence specifických primerů. Nejčastěji se používají první dvě varianty, tedy směs oligo (dT) a náhodné primery. V níže uvedené tabulce vidíte základní drhnutí a funkce všech 3 možných variant.

Název varianty Funkce Doporučení
OLIGO (dT) PRIMERY Oligo (dT) nasedají na poly (A) a  zadní části mRNA, tím pádem lze reverzní transkripci začít od začátku na 3 'konci mRNA. vhodné, pokud je k dispozici jen málo výchozího materiálu
NÁHODNÉ PRIMERY O délce šest až devět bází, které nasedají na všechny RNA (tRNA, rRNA a mRNA) na více místech podél přepisu, vytváří cDNA populaci, která pokrývá celý přepis. pokud je k dispozici málo výchozího materiálu, pro vysoký výnos z cDNA, ale cDNA je vyrobena ze všech RNA, což není vždy žádoucí
SEKVENCE SPECIFICKÝCH PRIMERŮ Zakázková výroba. Jedná se o primery specifické pro mRNA požadovaného pro reverzní transkripci. Umožňují specifickou a citlivou generaci cDNA. vhodné, pokud chcete snížit na pozadí základní nátěr a pokud chcete přepsat pouze konkrétní RNA

Prohlédněte si seznam všech nabízených PCR, qPCR, RT-PCR a dNTPs

Standard PCR
DreamTaq™ Green PCR Master Mix (2x)
DreamTaq™ Green DNA Polymerase
DreamTaq™ PCR Master Mix (2x)
DreamTaq™ DNA Polymerase
Taq DNA Polymerase (recombinant)
Taq DNA Polymerase (native)
PCR Master Mix (2x)
Real-time PCR
Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2x)
Maxima® Probe/ROX qPCR Master Mix (2x)
Maxima® SYBR Green qPCR Master Mix (2x), ROX Solution provided
Maxima® Probe qPCR Master Mix (2x), ROX Solution provided
Maxima® SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (2x)
Direct PCR
Fast Tissue-to-PCR Kit
Hot Start PCR
Maxima® Hot Start Green PCR Master Mix (2x)
Maxima® Hot Start PCR Master Mix (2x)
Maxima® Hot Start Taq DNA Polymerase
TrueStart™ Hot Start Taq DNA Polymerase
Fast PCR
PyroStart™ Fast PCR Master Mix (2x)
High Fidelity PCR
Pfu DNA Polymerase
High Fidelity PCR Enzyme Mix
Long Range PCR
Long PCR Enzyme Mix
PCR Cloning
CloneJET™ PCR Cloning Kit
InsTAclone™ PCR Cloning Kit
Reverse Transcription
Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR
Maxima® Universal First Strand cDNA Synthesis Kit (pouze pro USA a Kanadu)
Maxima® Reverse Transcriptase
RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit
RevertAid™ Premium Reverse Transcriptase
RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
RevertAid™ H Minus Reverse Transcriptase
RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit
RevertAid™ Reverse Transcriptase
First Strand cDNA Synthesis Kit
M-MuLV Reverse Transcriptase
AMV Reverse Transcriptase
RiboLock™ RNase Inhibitor
Nucleotides and Primers
Aminoallyl-dUTP
Biotin-11-dUTP
dATP
dCTP
dGTP
dITP
dNTP Mixes
dNTP Set
dNTP/dUTP Mix
dTTP
dUTP
Exo-Resistant Random Primer
Fluorescein-12-dUTP
M13/pUC Sequencing Primers
Oligo(dT)18 Primer
pJET1.2 Sequencing Primers
Random Hexamer Primer
Transcription Promoter Sequencing Primers
Buffers and Reagents
10x Taq Buffer with (NH4)2SO4
10x Taq Buffer with (NH4)2SO4 and 20 mM MgCl2
10x Taq Buffer with KCl
10x Taq Buffer with KCl and 15 mM MgCl210x Taq Buffer without Detergent
10x DreamTaq™ Buffer
10x DreamTaq™ Green Buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)
DEPC-treated Water
Water, nuclease-free

Máte zájem o produkty na polymerázovou řetězovou reakci? Kontaktujte nás!

Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné.



Zasílání novinek e-mailem

Zadejte Váš e-mail a nechte si zasílat novinky a zajímavé informace do vaší e-mailové schránky.

Zasílání novinek e-mailem

Rychlý kontakt

BIOGEN PRAHA s.r.o.
Ke sv. Izidoru 2293/4A
140 00 PRAHA 4

Tel.: +420 241 401 693
E-mail:

>> Kontakty společnosti
>> Kontakty na biobary

© 2017, BIOGEN PRAHA s.r.o. – všechna práva vyhrazena

Prohlášení o přístupnosti | Podmínky užití | Ochrana osobních údajů | Mapa stránek

Webové stránky vytvořila eBRÁNA s.r.o. | Vytvořeno na CMS WebArchitect | SEO a internetový marketing

Nahoru ↑