Ne všechny úseky lidské DNA vlastní cílová místa pro některý ze známých restrikčních enzymů. Existují úseky, kde by se mohla vyskytovat variabilita či mutace, respektive nějaká změna DNA, ale v okolí není žádná sekvence vhodná pro restrikci. Východiskem z takové situace může být technologie ligation-independent cloning (LIC) a systémy, které na principu LIC pracují. Tyto systémy umožňují klonovat jakýkoliv fragment a začlenit ho do libovolného místa v linearizovaném expresním vektoru, a to bez ohledu na enzymatickou restrikci.
Proces klonování může být ještě rychlejší a více účinný, například při použití kitů CloneJET PCR Cloning Kit nebo InsTAclone PCR Cloning Kit. Tyto výrobky pracují technikou TA klonování, stojící na schopnosti adeninu (A) a thyminu (T) spolu ligovat, neboli spojovat se. Vazba především tupých konců (ale mohou být takto spojeny i konce lepivé) vzniká prostřednictvím jednoho dodaného thyminového zbytku, který byl přenesen v podobě dideoxythymidin-trifosfátu (ddTTP), nebo přes dinukleotid s tímto thyminovým zbytkem.
CloneJET PCR Cloning Kit snižuje reakční dobu PCR klonování na pouhých 5 minut, zvyšuje účinnost reakce na více než 99 % a spojuje dvě různé molekuly DNA bez ohledu na ukončení neštěpených fragmentů (lepivé vs. tupé konce). V kitu je obsažen již připravený vektor pro klonování - pJET1.2/blunt s restrikčními místy a promotorem T7 pro in vitro i in vivo transkripci a případné sekvenování.
Druhý TA systém Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit v jednom kroku přímo klonuje PCR produkty zakončené 3'-dA přesahem. Děje se tak pomocí vektoru pTZ57R / T, který zajišťuje vysokou výnosnost klonování (více než 90 %).
Ligace neboli spojování dvou fragmentů DNA kovalentní vazbou, je v celém procesu klasického klonování in vitro stěžejním krokem. Při vazbě dochází ke vzniku fosfodiesterové vazby mezi 5´fosfátovou skupinou jednoho a 3´OH skupinou druhého řetězce, respektive fragmentu. Tuto důležitou reakci po katalytické stránce zajišťují enzymy z rodiny DNA ligáz. Nejčastěji užívaným enzymem, který se v buňce běžně účastní crossing-overu, replikace a opravy DNA, je T4 DNA ligáza získaná z buněk E. coli infikovaných fágem T4. Při samotné ligaci dochází ke spojování častěji lepivých konců a spotřebě energie dodané jednou molekulou ATP.
V laboratorních podmínkách se ligace provádí většinou za nižší teploty, než je teplota lidského těla, protože molekuly mají v takovém prostředí menší kinetickou energii. Pravděpodobnost nekomplementární vazby je pak redukována na minimum. Při rutinní teplotě 15-16 °C sice aktivita enzymu, efektivita i doba reakce není optimální, ale počet chyb při klonování je minimalizován a tedy nižší než v případě živých organismů při 37 °C, protože ty jsou schopny většinu chyb opravit. Disponují totiž, na rozdíl od experimentů in vitro, opravnými (reparačními) mechanismy k reparaci DNA.
I přes nízkou chybovost je však toto zpomalení techniky i nízký výtěžek nepříjemný faktor. Současný výzkum a nedávné pokroky nabízí nová řešení. Jedním z nich jsou kity (sady), v nichž je zahrnuta vysoce výkonná T4 DNA ligáza ve vhodném pufru a další komponenty urychlující některé reakce. Takovým je například Thermo Scientific Rapid DNA Ligation Kit s T4 DNA ligázou a speciálně připraveným pufrem, který je optimalizovaný právě pro rychlou a efektivní DNA ligaci nebo dále Rapid DNA Ligation Kit. Oba kity obsahují reakční komponenty pro ligaci fragmentů s tupými konci, při pokojové (laboratorní) teplotě a jen v 5 minutách. Všechny dodávané reagencie jsou již předem připraveny k pohodlnému a rychlému použití včetně činidla pro případnou opravu. Stačí jen přidat vlastní vyšetřované vzorky DNA a hotové reakční směsi lze přímo transformovat do bakterií.
Termín transformace je možné v genetice vyložit jako bezkontaktní přijetí cizorodé genetické informace určitým organismem, a právě to je zásadní odlišení od ostatních způsobů horizontálního přenosu genetického materiálu (konjugace, transdukce apod.). V přírodě transformace probíhá zejména přirozeně u bakterií, v laboratoři uměle in vitro v biotechnologiích genetického inženýrství. Mechanismus průniku DNA (do určité velikosti) spočívá v přichycení molekuly na buněčnou stěnu, průniku do cytoplazmy a zabudování cizorodé DNA do vlastní bakteriální dědičné informace, a to většinou způsobem crossing-over.
V České republice je v současné době nově k dostání Thermo Scientific TransformAid Bacterial Transformation Kit, který je díky speciálnímu roztoku T-solution unikátní svou vysokou účinností transformace více než 107 transformací na 1 µg plasmidové DNA, a protože i paleta použitelných bakteriálních kmenů je rozsáhlá a relativně dobrá je také doba kultivace, představuje tento kit při rutinních testech naprostý ideál.
