Nukleotidy a priméry

Nukleové kyseliny jsou makromolekulární látky, jejichž základní stavební jednotkou je nukleotid. Nukleotid se skládá ze tří částí:

1. cukerné složky – pentózy (monosacharid s pěti uhlíky), DNA obsahuje 2–deoxy–D–ribózu, RNA obsahuje D–ribózu
2. dusíkaté báze – je navázána na cukernou složku, existují 4 typy (podle nich rozlišujeme 4 typy různých nukleotidů): adenin (A), guanin (G), cytosin (C), thymin (T) – obsažený pouze v DNA a uracil (U) – obsažený pouze v RNA
  • adenin a guanin jsou báze purinové odvozené od purinu (heterocyklické sloučeniny se dvěma kondenzovanými heterocykly)
  • cytosin, thymin a uracil jsou báze pyrimidinové odvozené od pyrimidinu (šestičlenné heterocyklické sloučeniny se dvěma heteroatomy)
Ribóza s dusíkatou bází tvoří nukleosid.
3. fosfátu – zbytek kyseliny ortofosforečné, který je navázán na 5' uhlíku každého nukleotidu, a jeho prostřednictvím jsou navázány jednotlivé nukleotidy a tvoří polynukleotidový řetězec.

Nukleotidy a priméryPořadí jednotlivých nukleotidů spojených v polynukleotidový řetězec, tzv. primární struktura nukleových kyselin, určuje genetickou informaci organismu. Sekundární struktura nukleových kyselin je dána prostorovým uspořádáním polynukleotidového řetězce – molekula DNA je tvořena dvěma polynukleotidovými řetězci (je dvouvláknová) stočenými do dvoušroubovice, zatímco molekuly RNA jsou obvykle tvořeny jedním polynukleotidovým řetězcem (je jednovláknová).

Spojení mezi vlákny dvoušroubovice DNA je realizováno vodíkovými vazbami mezi bázemi na základě tzv. komplementarity:

  • cytosin je komplementární s guaninem a naopak
  • adenin je komplementární s thyminem (u DNA) nebo uracilem (u RNA) a naopak
  • mezi adeninem a thyminem se tvoří 2 vodíkové vazby, cytosin a guanin jsou spojeny 3 vodíkovými vazbami
V molekulární biologii se využívají nukleotidy jako základní stavební kameny pro in vitro syntézu DNA (PCR, reverzní transkripce) nebo RNA (in vitro transkripce).

Modifikované nukleotidy

Kromě přirozených/standardních nukleotidů jsou v metodách molekulární biologie široce využívány nukleotidy modifikované. Modifikaci mohou být podrobeny všechny tři části nukleotidu (cukerná část, fosfátová skupina i nukleobáze) v závislosti na potřebách dané aplikace - viz obrázek:

Aplikace

Nejběžnější modifikací nukleotidů je připojení fluorescenční značky (např. fluorescein) za účelem fluorescenčního značení DNA či RNA. Další významnou modifikací je zavedení chemicky reaktivní funkční skupiny (např. aminoalylová skupina) nebo reaktivních biomolekul (např. biotin) a jejich použití pro spojování s dalšími molekulami. Zavedení reaktivní aldehydové skupiny do DNA umožňuje např. barevně detekovat DNA díky typické reakci s arylhydraziny či kovalentně připojit peptid reduktivní aminací. Nejběžnějším systémem reaktivních molekul je biotin -streptavidin, což jsou proteiny vykazující vzájemně silnou afinitu. Tento systém se používá pro nepřímé značení DNA, kdy na biotinylované nukleotidy se váže streptavidin konjugovaný s fluorescenčním barvivem (např. Cy3 nebo Cy5).

Oligonukleotidy

Krátké nukleotidové řetězce se nazývají oligonukleotidy (několik desítek nukleotidů). Syntetické oligonukleotidy jsou vyráběny chemicky či enzymaticky a jejich využití je velmi široké např. primery při amplifikaci DNA nebo sekvenování, sondy detekující cílové sekvence při qPCR či sondy na microarrays. Primery lze zakoupit již validované (funkčně ověřené) výrobcem nebo si návrh sekvence můžete provést samy a primery si nechat nasyntetizovat na zakázku.

Nukleotidy a priméryExistuje řada webových programů (PrimerExpress nebo Primer3) pro návrh specifické sekvence primerů, kódujícího (forward) a antikódujícího (reverse) primeru. V ideálním případě by primery měly být jedinečné pro cílovou sekvenci a vykazovat malou pravděpodobnost vzniku dimerů, nespecifickou hybridizaci (annealing) a neměly by generovat pozitivní falešné výsledky.

Pro design primerů platí několik obecných pravidel, které je dobré dodržovat, abyste zajistili účinnou a specifickou amplifikaci:

  • délka primerů by měla být 15 až 25 nukleotidů
  • obsah GC se může pohybovat v rozmezí 20-70%, ale Tm primerů by se neměly výrazně lišit
  • vyhněte se umístění více než dvou nukleotidů G nebo C v posledních pěti nukleotidech na 3'-konci, aby se snížilo riziko nespecifického nasednutí primerů.
  • vyhněte se sekundárním strukturám v amplikonu.
  • vyhněte se komplementaritě v rámci primeru, komplementaritě mezi primery a přímým repeticím v primeru, aby se zabránilo tvorbě vlásenek a dimerizaci primerů
  • u primerů pro real-time PCR je optimální teplota tání (Tm) 60 °C, rozdíly v Tm obou primerů by neměly větší než 2 °C.
Při aplikaci real-time PCR musí být zohledněny i strukturní a reakční požadavky na oligonukleotidovou sondu. Nejdříve navrhněte sondu a potom vyberte primery, které obklopují oblast sondy.

Obecné pokyny pro návrh dvojitě značených sond, jako jsou TaqMan sondy:

  • obsah GC: 30-60%.
  • délka: 20-30 nukleotidů
  • Tm by měla být o 10°C vyšší než Tm primerů (obvykle 68 až 70°C)
  • v blízkosti 5 'konce TaqMan sondy by se neměl vyskytovat G (může zhášet fluorescenci)
  • sekvence by neměla obsahovat opakující se motivy stejné báze (může to mít vliv na účinnost hybridizace v důsledku tvorby sekundární struktury)
  • vyberte templátové vlákno DNA, které obsahuje více C než G bazí
  • vyhněte se sekundárním strukturám
  • vyhněte se dimerizaci s primery
  • modifikace nukleových kyselin jako LNA (Locked Nucleic Acids), PNA (Peptide Nucleic Acids) a MGB (Minor Groove Binders) mohou být použity pro optimalizaci Tm nebo délky sondy 

Webové aplikace pro navrhování primerů

BLAST Vyhledává necílové sekvence shodné s potenciální sekvencí primerů.
Primer 3 Navrhuje sekvenci primerů.
RTPrimerDB Databáze primerů nabízející již předdefinované a ověřené sekvence primerů.
NCBI Používá Primer3 pro návrh primerů a poté je podrobí analýze BLAST.
Tm Calculator Podle obsahu GC provádí výpočet teploty tání.
Oligonukleotidy mohou obsahovat modifikované nukleotidy na koncích nebo uprostřed řetězce.

Máte zájem o Nukleotidy a priméry? Napište nám!

Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné.



Zasílání novinek e-mailem

Zadejte Váš e-mail a nechte si zasílat novinky a zajímavé informace do vaší e-mailové schránky.

Zasílání novinek e-mailem

Rychlý kontakt

BIOGEN PRAHA s.r.o.
Ke sv. Izidoru 2293/4A
140 00 PRAHA 4

Tel.: +420 241 401 693
E-mail:

>> Kontakty společnosti
>> Kontakty na biobary

© 2017, BIOGEN PRAHA s.r.o. – všechna práva vyhrazena

Prohlášení o přístupnosti | Podmínky užití | Ochrana osobních údajů | Mapa stránek

Webové stránky vytvořila eBRÁNA s.r.o. | Vytvořeno na CMS WebArchitect | SEO a internetový marketing

Nahoru ↑