Ligace a klonování systémem Rapid DNA Ligation Kit

Slova úvodem: Jak probíhá ligace a klonování

Systém obsahuje vektor, do kterého je vložen vyšetřovaný fragment, respektive PCR produkt po štěpení, a oba jsou následně spojeny při tzv. ligaci. Tuto ligační reakci řídí enzym T4 DNA ligáza, která katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi vzájemně cizími úseky DNA. Ligace pomocí kitu Rapid DNA Ligation Kit umožňuje sjednotit štěpené PCR produkty, a to jak s přesahujícími tak tupými konci a po té přejít plynule k následujícímu kroku klonování – transformaci, kdy je rekombinantní vektor přímo namnožen.

Už i tak velmi dobré vlastnosti (rychlost, kvalita a výtěžek) se mohou dále zvýšit kombinací použitých komerčních sad, jako například při použití kitu TransformAid™ Bacterial Transformation Kit k přípravě kompetentních buněk. Aplikací tohoto systému je příprava odpovídajících bakteriálních kolonií nesrovnatelně rychlejší a doba od amplifikace původní sekvence v místě s variabilitou (eventuálně s mutací nebo jinou numerickou či nukleotidovou aberací) až po transformaci je podstatně kratší.

Rapid DNA Ligation Kit je schopen spojit PCR produkt s linearizovaným vektorem, přičemž tyto DNA se mohou libovolně kombinovat bez ohledu na jejich původ. Po ligaci je rekombinantní vektor začleněn do libovolného hostitelského organismu. V případě DNA analýz dle postupu sady TransformAid™ Bacterial Transformation Kit jde o transformaci do buněk E.Coli. Nejčastěji bývají transformovány běžné laboratorní kmeny této bakterie.

Systém Rapid DNA Ligation Kit poskytuje při reakci vysokou účinnost spojování (vytváření fosfodiesterových vazeb) a taktéž jistý komfort při samotné analýze. Laboratorní práce je totiž díky těmto produktům velmi usnadněna a příjemná rovněž jejich komplexita, což znamená, že jednotlivé komerční sady na sebe navazují bez nutnosti nákupu dalších speciálních chemikálií.

Obecné

• Veškeré komponenty pro daný krok celého procesu klonování jsou v konkrétních kitech obsaženy, všechny přípravky jsou zdraví nezávadné a šetrné k životnímu prostředí.
• Speciální chemikálie, jako například reakční pufry nebo vektory, byly navrženy a optimalizovány speciálně pro klonování DNA vzorků v bakteriálních buňkách E. Coli.
• Jejich specifikace byla potvrzena také experimentálně.

Ligace

• PCR produkt, který má po restrikci:

1. tupá zakončení (blunt-end): T4 DNA ligáza spojuje s defosforylovaným vektorem DNA fragment o délce 2.3 kb, který byl štěpen restrikčním enzymem SmaI. Pozn.: kontrolní DNA - pUC19 DNA; restriktáza - SmaI; defoforylace - alkalická fosfatáza.
2. přesahující konce (sticky-ends): T4 DNA ligáza spojuje s defosforylovaným vektorem DNA fragment o délce 2.1 kb, který byl štěpen restrikčním enzymem PstI. Pozn.: kontrolní DNA - pUC19 DNA; restriktáza - PstI; defoforylace - alkalická fosfatáza.

• Ligační reakci vyhovují PCR produkty, které jsou kratší než 1 kb a pokud mají na gelu jeden čistý band v odpovídající zóně, nemusí být čištěny (purifikovány). V takovém případě je ale důležité, nepřekračovat objem 2-5 μl do reakce.
• Čistota DNA hraje při ligaci důležitou roli a navíc, přítomnost primerů-dimerů a dalších nečistot nelze vyloučit ani v případě, že nejsou vidět po separaci na agarózovém gelu. Avšak i tyto mohou ovlivnit úspěšnost ligační reakce i další navazující kroky. Proto je vhodné plazmid přečistit (purifikovat), například pomocí Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep Kit.
• Při ligaci je nutné dodržet doporučené maximální množství DNA vektoru, tj. 200 ng pro reakci v objemu 20 μl.
• Aktivitu ligázy snižuje sůl přítomná v PCR reakčním pufru. Z toho důvodu by přidaný objem PCR produktu měl být pro ligaci minimální. Nicméně kvalita výsledných klonů ani proces klonování není při optimálním množství ovlivněna.
• Optimální molární poměr insert/vektor je 3:1. Pozn.: Vysvětlení vzorce pro výpočet molárního poměru je uveden na internetových stránkách společnosti Thermo Fisher Scientific.

Transformace

• Transformace do 50 μl kompetentních buněk E. Coli systémem TransformAid Bacterial Transformation Kit úspěšně probíhá při objemu reakčního roztoku 2.5 μl a ligační směsi. 5 μl.
• Stanovení účinnosti: transformace XL1-Blue buněk E.coli.

1. LIGACE

Reakční směs je navržena tak, aby vzorek po PCR reakci mohl být přímo ligací vložen do linearizovaného vektoru a transformován do bakteriální buňky E. Coli, a to jak klasickou metodou, jako například elektroporace, tak pomocí návazného TransformAid Bacterial Transformation Kit.

Správná funkce toho kitu byla potvrzena experimentálně, konkrétně při klonování 2000bp dlouhého PCR produktu o délce 2000 bp a hmotnosti 130 ng, který byl zakončen tupými konci a současně 50 ng PCR produktu kontrolní pUC19 DNA (součástí kitu). DNA byly štěpeny enzymem SmaI a vzniklé tupé konce spojeny ligací s využitím systému Rapid DNA Ligation Kit a deforforylovány alkalickou fosfatázou. Výtěžek, respektive množství bílých kolonií po transformaci do kompetentních E.coli XL1-Blue buněk, činil >1x105 cfu/μg DNA s účinností transformace 1x107 buněk na 1μg DNA.

• Před začátkem práce je nutné nastudovat celý manuál (pracovní protokol), obdobně sestavit vlastní postup pro konkrétní DNA vzorky a zajistit dostatečné množství ledu.
• V den provedení reakce do laminárního boxu připravit všechen materiál i pomůcky, zmražené látky nechat za laboratorní teploty rozmrazit (případně držet na ledu), promíchat a krátce „stočit“ na mikrocentrifuze.
• Po té pro jeden produkt připravit reakční směs (viz níže) a pokud nebude tato i směs, pro kterou je příprava uvedena dále (viz recirkulizace vektoru) ihned zpracována, je možné ji v obou krocích skladovat při teplotě 0-4°C.
• Před elektroporací je třeba provést chloroformovou extrakci a pro transformaci odebrat pouze 1 μl extrahovaného roztoku.

Předpis pro jeden vzorek:

1. Do předem popsané 0,2 μl zkumavky připravit na ledu následující reakční směs o celkovém objemu 20 μl:

Takto připravenou směs krátce vortexovat a centrifugovat 3 – 5 s.

2. Reakční směs inkubovat 5 minut při laboratorní teplotě (cca. 22°C).
3. Použít 2-5 μl této inkubované směsi přímo pro transformování kompetentních buněk.

Linearizovaný vektor má tendenci spojit se opět v jeden celek (recirkulizovat) a tím by se ligace stala obtížnější. Uzavření plasmidu lze bránit defosforylací, např. enzymem FastAP Alkaline Phosphatase nebo Shrimp Alkaline Phosphatase.

Recirkulizace probíhá v objemu 50 μl této reakční směsi (předpis pro jeden vzorek):

1. Do předem popsané mikrozkumavky připravit následující reakční směs (celkový objem 50 μl):

Takto připravenou směs krátce vortexovat a „stočit“ na mikrocentrifuze (cca. 3 – 5 s).

2. Reakční směs inkubovat 5 minut při laboratorní teplotě (cca. 22°C).
3. Použít 2-5 μl této inkubované směsi přímo pro transformování kompetentních buněk.

NÁVAZNÉ ZPRACOVÁNÍ

2. TRANSFORMACE

Vektor s analyzovaným fragmentem je přenesen přes buněčnou a cytoplasmatickou membránu do vnitřního prostředí bakteriální buňky (transformace) a zde se množí (klonuje). Úspěšnost transformace je různá a liší se dle použité techniky. Nejúčinnější je elektroporace (109 cfu/μg DNA), avšak tato metoda je vhodná především pro rozsáhlé úseky o délce > 3 kb. Nejrychleji je naopak rekombinantní vektor přenesen pomocí komerčně dostupných kitů. Na předešlou ligaci sadou Rapid DNA Ligation Kit snadno navazuje např. TransformAid Bacterial Transformation Kit, který je doporučován nejen pro snadnost, ale především pro rychlost transformací.

• Při použití komerčně připravených kompetentních buněk, je nutné dodržovat postupy dle dodavatele.
• TransformAid Bacterial Transformation Kit zajišťuje rychlou a současně flexibilní přípravu kompetentních buněk a efektivní transformaci.
• Příprava kompetentních buněk, do nichž je posléze transformován rekombinantní vektor, může probíhat přes noc v roztoku, který je součástí kitu nebo na agarózových plotnách (cca. 2.5 hodiny).

3. ANALÝZA – GELOVÁ ELEKTROSEPARACE

Účinnost ligace, tedy množství spojených molekul DNA z celkového množství v reakční směsi, je stanovena (odečtena, určena) na základě pruhů na agarózovém gelu. Tyto tzv. bandy jsou odečítány po separaci produktů a koncentrace, resp. množství, bývá v praxi většinou odhadnuto ze srovnání se standardem, například GeneRuler DNA Ladder Mix.

Při nanášení vzorků je nutné k oddělenému alikvotu přidat SDS-supplemented loading dye, což je SDS sonda eliminující posun bandů (např. 6X DNA Loading Dye & SDS Solution), které je způsobeno nejčastěji navázáním T4 DNA ligázy na ligační produkt.

4. INTERPRETACE

Slábnoucí tendence bandů (tzv. profil vzorků), odpovídá klesající molekulové hmotnosti. Tento profil indikuje úspěšně provedenou ligaci. Profil bez viditelných změn poukazuje na problémy během ligace.

Pozn.: Nejsilnější bandy charakterizují vzorky o nejvyšší koncentraci DNA, nejslabší naopak nejmenší množství DNA a t z nich, které při elektroseparaci postupují nejpomaleji mají nejvyšší molekulovou hmotnost (závislost na rychlosti putování je nepřímá).

Další podrobné informace seženete v odborné literatuře

1. Rand, K.N. Crystal Violet can be used to Visualize DNA Bands during Gel Electrophoresis and to Improve Cloning Efficiency. Elsevier Trends Journals Technical Tips. Online. T40022. 1996.
2. Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels and educational demonstrations. Anal Biochem. 240 (1), 17-23. 1996.