Thermo Scientific™ MuSeek Library Preparation Kit pro Ion Torrent™

Thermo Scientific MuSeek Library™ Preparation Kit pro Ion Torrent™ je určen pro konstrukci vysoce kvalitních genomových DNA knihoven pro sekvenování na systémech Ion Personal Genome Machine™ (PGM™) a Ion Proton™. Rychlý protokol využívá enzym MuA transpozázu, která katalyzuje současně fragmentaci cílové dvouřetězcové DNA a označení konců fragmentů transpozónovou DNA. V následném kroku PCR jsou adaptéry specifické pro danou platformu přidány pomocí robustní a přesné Thermo Scientific Phusion™ High-Fidelity DNA polymerázy. Stejný protokol může být použit pro konstrukci knihovny s 100-400bp inserty při použití pouze 100ng výchozího vzorku.

Kit obsahuje reagencie dostatečné pro 10 fragmentací a následných PCR reakcí. Kit obsahuje také MuA specifický sekvenační primer, který je potřeba pro PGM sekvenování, když jsou touto metodou připraveny knihovny bez čárového kódu.Schéma pracovního postupu:

Princip technologie

MuA transpozáza je enzym (75 kDa) pocházející z bakteriofága Mu a je produkován jako rekombinantní protein v E. coli. Za vhodných podmínek MuA transpozáza tvoří homotetramerický komplex se dvěma 50 bp konci dvouvláknové DNA transpozónu, který obsahuje specifickou MuA vazebnou sekvenci. Po fragmentační reakci jsou konce cílové DNA označeny sekvencemi transpozónu.

PGM-specifické adaptéry jsou připojeny k fragmentům v následující adaptér-adiční PCR reakci. Nejprve 3'-konce fragmentované cílové DNA jsou prodlouženy přes 5nt mezer, které vznikly transpozicí, a poté je DNA prodloužena o transpozónové sekvence. V počátečních cyklech PCR, prvních 16nt na 3'-konci adaptéru, hybridizuje s transpozónovou sekvencí v prodloužených DNA fragmentech. V pozdějších cyklech PCR jsou fragmenty amplifikovány pomocí dvojice vnějších primerů.

Struktrura sekvence adaptéru obsahujícího cílový DNA fragment (bez čárového kódu a s čárovým kódem)

TCAG oblast je klíčová sekvence (čtyři různé báze), která se používá pro kalibraci přístroje Ion Torrent. Sekvenační čtení začíná za klíčovou sekvencí a když je dosaženo konce fragmentu, čtení vstoupí do TGAA sekvence transpozónu. Sekvence odpovídající primeru A´ a komplementární k primeru P´ jsou znázorněny kurzívou.

Příprava knihoven s čárovým kódem

MuSeek Library Preparation Kit pro Ion Torrent™ lze použít pro konstrukci DNA knihoven s čárovým kódem, ale musí být použity v kombinaci MuSeek Barcode Set 1 (Ion Torrent™ compatible) (Cat #K1541). MuSeek Barcode Set 1 (Ion Torrent ™ kompatibilní) poskytuje 1-16 MuSeek adaptor-primer směsí s čárovým kódem, z nichž každý umožňuje připojení unikátní Ion Torrent PGM™ - kompatibilní sekvence čárového kódu. Toto umožňuje výzkumníkům spojit až 16 knihoven před výběrem velikosti a emulzní PCR, a pak provést multiplexní sekvenování.

Důležité poznámky:

Pro sekvenování knihoven bez čárových kódů, vytvořených pomocí tohoto kitu, používejte pouze MuSEEK sekvenační PRIMER dodávaný v tomto kitu! Pro sekvenování knihoven s čárovým kódem, vytvořených pomocí tohoto kitu, používejte vždy pouze originální sekvenační primer dodávaný v LIFE TECHNOLOGIES ION sekvenačním kitu! Sekvenační data nebudou generována při ION sekvenování, pokud použijete špatné primery, neboť vazebná místa primerů jsou odlišná pro knihovny bez a s čárovým kódem.

Další požadované reagencie a vybavení, která nejsou součástí kitu:

• Agencourt ® AMPure ® XP Purification system (Beckman Coulter, Inc, Cat # A63880, A63881 #, # A63882)
• 70% etanol (nutný při izolaci pomocí magnetických kuliček)
• Vybavení pro výběr velikosti, jako je E-Gel ® systém (Life Technologies, Inc)
• Pro přípravu NGS knihovny s čárovým kódem je potřeba Thermo Scientific MuSeek Barcode Set 1 (Cat #K1541)
• Stojan pro izolaci pomocí magnetických kuliček

Požadavky na výchozí DNA a obecná doporučení:

• Kit je optimalizovaný pro použití 100ng vysoce kvalitní genomové DNA, která může být rozpuštěná ve vodě bez nukleáz, 10 mM Tris, pH 7,5-8,5 nebo TE pufru (10 mM Tris -Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Vzorky DNA musí být bez kontaminujících proteinů, RNA, organických rozpouštědel a solí. U vzorků DNA s neznámou kvalitou doporučujeme přečištění. Nejlepší kvalita DNA je dosažena při purifikaci vzorků pomocí komerčních kitů, jako je Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Cat. #K0721, #K0722).
• Pro konstrukci NGS knihovny z PCR amplikonů ve fragmentační reakci nepoužívejte PCR produkty kratší než 300bp. V důsledku vnitřních vlastností transpozónu ~ 50 bp „drop off“ se očekává v sekvenačním pokrytí u každého distálního konce amplikonové sekvence. Tento problém může být vyřešen navržením amplikonů delších o ~ 100 bazí než má sekvenovaný insert.
• Kontrolní DNA je k dispozici v kitu pro zavádění metody před použitím vlastních vzorků DNA. Použijte 100ng (2ul) z kontrolní DNA dodávané v kitu, a pak postupujte podle pokynů popsaných níže.
• Dodržujte pravidla správné laboratorní praxe s cílem minimalizovat křížovou kontaminaci produktů. Používejte špičky s filtry, a pokud je to možné, provádějte konstrukci knihovny v odděleném prostoru nebo místnosti.
• Rozmrazujte roztoky před použitím na ledě a udržujte je na něm, dokud nejsou připraveny k použití. Minimalizujte čas skladování roztoku MuSeek Enzyme Mix mimo -70 °C.
• Promíchejte roztoky důkladně na vortexu před každým použitím.
• Pro optimální výsledky připravte vždy čerstvý 70% roztok etanolu před začátkem purifikace (70% etanol je hydroskopický).

PROTOKOL

A. Fragmentační reakce

1. Napipetujte všechny reagencie, s výjimkou MuSeek Enzyme Mix, v daném pořadí do tenkostěnné 0,5 ml zkumavky. Udržujte směs na ledu. Směs promíchejte krátce na vortexu a důkladně centrifugujte.

2. Pro úspěšnou fragmentaci DNA zabraňte pěnění reakční směsi! Před začátkem zapněte vortex na maximální rychlost. Přidejte MuSeek Enzyme Mix do ostatních složek reakce a promíchejte dotykem vortexu (pětkrát pokaždé na 1 sekundu), krátce centrifugujte. Ihned zkumavku inkubujte 5 minut při teplotě 30 °C. Doporučujeme vzorek inkubovat ve vodní lázni pro rychlejší přenos tepla. Co nejdříve vraťte MuSeek Enzyme Mix do mrazáku -70 °C

3. Zastavte reakci po 5 minutách přidáním 3ul MuSeek Stop roztoku a krátce vortexujte.

4. Po vortexování udržujte zkumavku při pokojové teplotě. Nedávejte reakční zkumavku na led, Stop roztok může způsobit vysrážení.

5. Proveďte purifikaci fragmentované DNA pomocí Agencourt™ AMPure™ XP PCR Purification system. Tento kit je navržen pro práci s Agencourt ™ AMPure ™ XP PCR purifikačním systémem, a proto nedoporučujeme používat jiné systémy pro izolaci. Inkubujte magnetické kuličky při pokojové teplotě alespoň 30 minut před zahájením purifikace a před pipetováním dobře promíchejte.

• Přeneste vzorek DNA do 1,5 ml zkumavky.
• Přidejte 49,5 ul vytemperovaných Agencourt AMPure XP magnetických kuliček na reakci (objem 1,5 x vzorku) a důkladně promíchejte pipetováním nahoru a dolů (10-krát) (tak aby se zabránilo tvorbě pěny).
• Inkubujte po dobu 5 minut při pokojové teplotě.
• Centrifugujte krátce a vložte zkumavku do magnetického stojanu na 2-4 minuty nebo dokud není roztok čirý.
• Opatrně odsajte a odstraňte supernatant, aniž byste porušili kuličky. Ujistěte se, že žádný supernatant není vlevo.
• Ponechte zkumavku ve stojanu a přidejte 400ul čerstvě připraveného 70 % etanolu přímo na magnetické kuličky, inkubujte po dobu 30 sekund a odstraňte celý supernatant. Tento krok opakujte.
• Otevřete zkumavku na 2-5 minut a nechte oschnout magnetické kuličky na magnetu, tak aby se veškerý etanol odpařil. Dávejte pozor, abyste kuličky nepřesušili (to může být pozorováno jako praskání kuliček).
• Vyjměte zkumavku z magnetického stojanu a důkladně promíchejte kuličky v 25ul vody bez nukleáz, míchejte pipetováním nahoru a dolů (10- krát).
• Zkumavku vložte zpět do magnetického stojanu a nechte ji tam, dokud není roztok čirý (alespoň 1 minutu).
• Odeberte supernatant, aniž by se rozvířila peleta kuliček, do nové sterilní zkumavky. Tento supernatant obsahuje čistou fragmentovanou DNA. Supernatant nevyhazujte!

B. Připojení adaptérů

1. Vezměte 20 ul přečištěné fragmentované DNA z kroku čištění (popsán výše) a přidejte do reakční směsi (1,5 ml zkumavka) při pokojové teplotě:

2. Rozdělte reakční směs do čtyř samostatných 200ul PCR zkumavek (u některých termocyklerů se nedoporučuje amplifikovat DNA v reakčním objemu vyšším než 50ul).

3. Proveďte PCR ve všech čtyřech reakčních směsích podle následujících podmínek:

4. Spojte všechny čtyři reakce do jedné 1,5 ml zkumavky a proveďte purifikaci DNA pomocí Agencourt AMPure XP PCR purifikačního systému:

• Přidejte 360ul vytemperovaných Agencourt ™ AMPure ™ XP magnetických kuliček na reakci (objem 1.8x vzorku) a důkladně promíchejte pipetováním nahoru a dolů 10- krát (aby nedošlo k tvorbě pěny).
• Inkubujte po dobu 5 minut při pokojové teplotě.
• Rychle stočte zkumavku a vložte ji do magnetického stojanu po dobu 2 minut nebo dokud nebude roztok čirý.
• Odsajte opatrně supernatant, aniž by se narušily kuličky a supernatant vyhoďte. Ujistěte se, že žádný supernatant není vlevo.
• Nechte zkumavky ve stojanu a přidejte 1000 ul čerstvě připraveného 70 % etanolu přímo na magnetické kuličky (ujistěte se, že všechny kuličky jsou pokryty etanolem), inkubujte po dobu 30 sekund a odstraňte supernatant. Tento krok opakujte.
• Nechte oschnout kuličky na vzduchu na magnetu, otevřete zkumavku na 2-5 minut, což by mělo odpařit všechny stopy etanolu. Dávejte pozor, abyste kuličky nepřesušili (to může být pozorováno jako praskání kuliček).
• Vyjměte zkumavku z magnetického stojanu a důkladně rozpusťte kuličky v 20ul vody bez nukleázy nebo 10 mM Tris - HCl , pH 8,0.
• Zkumavku vložte do magnetického stojanu a nechte ji tam, dokud není roztok čirý (po dobu alespoň 1 minuty).
• Odeberte supernatant do nové sterilní zkumavky, aniž by se rozvířila peleta kuliček. Tento supernatant obsahuje čistou fragmentovanou DNA, supernatant nevyhazujte.

C. Výběr velikosti a kvantifikace knihovny

1. Výběr DNA knihovny se správnou délkou fragmentu

Knihovny připravené pro sekvenování pomocí MuSeek Library Preparation Kit pro Ion Torrent™ obsahují DNA fragmenty o délce ~ 150 - 1 500bp. Každý fragment obsahuje adaptérovou sekvenci na obou koncích, celkově 93bp u knihoven bez čárového kódu. Při výběru velikosti knihovny pro příslušnou délku sekvenačního čtení musíte brát v úvahu délku adaptérů. Výběr správné velikosti píku u DNA knihovny ukazuje následující tabulka.

2. Doporučení pro výběr velikosti

Pro provedení efektivní emulzní PCR a následné sekvenační reakce doporučujeme výběr velikosti na systému E-Gel® Agarose Gel Electrophoresis s použitím E-Gel® SizeSelect™ 2% Agarose Gel. Návod naleznete na www.lifetechnologies.com. Odeberte 1ul finální knihovny pro analýzu distribuce velikostí fragmentů a stanovení koncentrace pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer.

3. Hodnocení připravené knihovny pro sekvenování

Shromážděte všechny vzorky uložené z fragmentační reakce, z PCR připojení adaptérů a z výběru velikosti pro analýzu pomocí přístroje Bioanalyzer Agilent 2100. Před zahájením nařeďte vzorky po fragmentační reakci 2 - krát a vzorky po PCR připojení adapterů 4 - krát. Vzorky po E- Gel ® výběru velikosti nesmí být ředěny. Analyzujte všechny vzorky dohromady na Bioanalyzer 2100 pomocí kitu High Sensitivity DNA (Cat #5067-4626).

4. Doporučení pro výběr velikosti DNA knihoven s čárovým kódem

Smíchejte všechny knihovny s čárovými kódy ve stejném molárním množství před E - Gel výběrem velikosti tak, aby konečný objem směsi byl větší než 25ul. Doporučujeme výpočet molarity jednotlivých knihoven pouze v cílových intervalech, které jsou odlišné pro 100-400 bp knihovny (viz tabulka), jako například pro 200 bp čtení, vypočítejte molaritu v oblasti 297 až 363 bp, což odpovídá následnému výběru velikosti cílového píku (± 10 %).

Relativní distribuce velikostí fragmentů DNA knihovny (z E. coli) připravené pomocí MuSeek Library Preparation Kit

Distribuce velikostí fragmentů byla analyzována na Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí kitu High Sensitivity DNA (Life Technologies). Červená - 2násobné ředění DNA fragmentů po fragmentační reakci; modrá - 4násobné ředění DNA fragmentů po PCR připojení adaptérů; zelená - fragmenty po výběru velikosti na E-Gel® Agarose Gel Electrophoresis Systemu s použitím E-Gel® SizeSelect™ 2% Agarose Gel.

D. Sekvenování